长期以来,手性氨基酸都被认为对淀粉样蛋白(Amyloid beta peptide, Aβ)结构和功能有调控作用。然而,这背后的分子机制并不是十分清晰,最近,又有了新的进展。2019年11月6日,美国威斯康星大学麦迪逊分校李灵军课题组(第一作者李功玉)在Nature Communications杂志上发表了一篇题为“Molecular Basis for Chirality-regulated Aβ Self-assembly and Receptor Recognition Revealed by Ion Mobility-Mass Spectrometry”的文章,通过新型离子迁移质谱揭示了氨基酸手性对Aβ结构的影响。


UW-Madison发现揭示氨基酸手性调控的淀粉样蛋白结构


UW-Madison发现揭示氨基酸手性调控的淀粉样蛋白结构


该文通过开发一整套基于新型离子迁移质谱的快速手性分离分析平台(作者将该方法命名为integrative chirality anatomy platform, iCAP),覆盖了Aβ单体,多聚物和受体结合复合物的氨基酸手性效应,重点克服了传统离子迁移质谱在结构分辨率上的不足,实现不改仪器硬件的前提下提高超过十倍结构分辨率,成功从手性混合物中分辨出单个氨基酸手性突变的Aβ立体异构体,并揭示了不同氨基酸手性突变对其聚集倾向和受体结合的差异性影响,重点关注自然界常见手性突变的天冬氨酸(Asp)和丝氨酸(Ser)。该研究揭示了在未来针对老年痴呆症的药物开发时,手性突变的Aβ异构体也应该作为靶向研究不可忽略的一个方面,毕竟氨基酸的手性影响着Aβ的各方面物理化学性质。


UW-Madison发现揭示氨基酸手性调控的淀粉样蛋白结构

图1. 快速手性分离分析平台流程示意图。


图1显示的是快速分离分析平台的“三步骤”工作流程示意图。第一步,针对手性突变的Aβ单体,作者提出用“金属离子放大法”,即通过多肽-金属离子相互作用依赖于多肽本身结构的这个属性,将多肽结构的差异和多肽-金属复合物的结构差异结合起来分析(图1a),以此来放大Aβ个别氨基酸手性突变引起的单体结构差异性。第二步,通过绘制Aβ寡聚物生长曲线的方式(图1b),从分子量水平上可视化Aβ的聚集过程。进一步计算每一个寡聚物的结构差异,并提出一种全新的手性放大计算法(图1d),从而实现从结构变化的角度定量表征Aβ聚集过程中的手性效应。第三步(图1c),作者使用了近年来比较流行的蛋白质气相结构分析工具,“碰撞诱导解折叠”(collision-induced unfolding, CIU),结合溶液相动力学手段,系统表征了氨基酸手性在Aβ-受体相互作用过程中的影响。值得一提的是,作者本文所采用的是Aβ片段(包括N-端和C-端),这样就可以在不受干扰的前提下,针对性研究手性对不同结构域的结构影响程度。


多肽-金属离子的结合是被广泛认可的会调节淀粉样蛋白聚集的几个重要因素之一。本文作者创造性地利用金属离子结合依赖于多肽本身结构的特点,基于手性突变的多肽在结构上会有一些差异,因此金属离子结合以后的复合物在结构上应该也会有所不同。如何将多肽本身的结构差异和金属离子结合的多肽复合物的结构差异统一起来,以此实现手性差异放大,成为本文工作的一大亮点。作者对Aβ单体和其他神经肽进行了手性分析。在收集到apo-多肽、结合一个Cu的多肽复合物和结合两个Cu的多肽复合物的结构信息之后(CCS,collisional cross-section, 碰撞截面),作者依次将相关结果呈现在一维、二维和三维的坐标轴上。当只考虑apo-多肽的结构信息时,手性分离的效果很差,很多情况下几乎无法分开。这是由于这些多肽大都只有一个或少数几个氨基酸位点发生手性突变,因此结构改变也很小,一般的商业化的离子迁移质谱无法将其分开。有趣的是,在二维分离坐标中,作者发现原来拥挤在一块的D-和L-神经肽被有效地拉开了,这是由于引入了一个Cu-结合的多肽复合物结构信息,手性效应由此被放大。这种手性放大效应可以通过引入第三个坐标,结合两个Cu-的多肽复合物的结构信息,进一步被放大。


老年痴呆症的一个典型特征是大脑中细胞周围的淀粉样斑块沉积。一直以来,这种淀粉样斑块都被认为与老年痴呆发病机制密切相关,虽然目前的机理尚不明确。因此,作者也针对性地开发了相关策略用于研究氨基酸手性突变对Aβ 聚集过程的影响。他们将该平台应用于Aβ 聚集过程中的氨基酸手性效应研究。他们发现各种条件下的手性突变并不会大幅度改变生长方式,即单个氨基酸手性突变不会显著影响整条Aβ 聚集路径。有趣的是,作者发现,双氨基酸(Asp和Ser)共同突变会显著降低最高的聚合度。作者进一步利用多维手性放大计算法,结合该快速手性分离分析平台,数据表明,手性突变对Aβ 聚合物的结构改变程度遵循以下顺序:双氨基酸(Asp和Ser)共同突变 > 单点Asp突变 > 单点Ser突变。这一点上看,手性效应在Aβ单体和寡聚物的结构方面的影响是一致的。值得一提的是,这种手性效应在混合野生型和突变型Aβ之后变得更加明显,而这可能是更接近实际生物体系的情况,因为在实际条件下,两者在很大概率情况下会共存。


然而,蛋白或者多肽一般不会独自起作用。相反,绝大部分条件下,这些蛋白或多肽需要与周围环境中的多种结合受体发生各种动态的相互作用,以发挥他们的有效功能。因此作者最后还考察了氨基酸手性突变对其受体结合能力的影响。为了实现这一目标,作者首先诉诸于快速的气相结构分析手段,CIU-IM-MS,即碰撞诱导去折叠离子迁移质谱的方法(Collision-induced Unfolding-Ion Mobility-Mass Spectrometry)。该技术手段可以在消耗很少样品的前提下,快速有效灵敏地揭示蛋白质在气相中的局部微小的蛋白质结构转变。其次作者还进一步使用了溶液相动力学手段SPR,即surface plasmon resonance ,表面等离子共振技术,检测了手性突变对受体结合的动力学差异。作者总结D-型突变显著降低了受体结合的亲和力以及对应的结合速率。总的来说,C端Aβ片段和TTR(transthyretin, 甲状腺素转运蛋白)的结合都在微摩尔级别,相对比较弱。而作者进一步对N端Aβ片段和HSA(human serum albumin, 人血清白蛋白)的结合进行了手性分析。结果显示,手性突变对N端Aβ-HSA 结合具有破坏性的作用而且其程度遵循以下顺序:双氨基酸(Asp和Ser)共同突变 > 单点Asp突变 > 单点Ser突变。综合起来看会发现,手性效应在Aβ单体、寡聚物结构以及N端Aβ-HSA 结合方面的影响是一致的。然而,手性突变对C端Aβ-TTR 结合具有破坏性的作用却遵循以下顺序:单点Asp突变 > 单点Ser突变 > 双氨基酸(Asp和Ser)共同突变。作者认为这些结构域依赖性的手性效应应该跟Aβ本身的结构特点相关,因为它本身的N端和C端具有截然不同的晶体结构。进一步对该假说进行验证以及在完整序列的Aβ上研究手性突变的影响会使本文的发现更有实际意义。


关于β-淀粉样蛋白


β-淀粉样蛋白(amyloid β-protein,Aβ)分子量约4kDa,由β淀粉样前体蛋白(β-amyloid precursor protein,APP)水解而来,由细胞分泌,在细胞基质沉淀聚积后具有很强的神经毒性作用。

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